而抗生素的檢測可以通過內(nèi)酰胺酶檢測來進行，具體有以下兩種方法：

 

　　1、間接法

 

　　方法原理：利用β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度會減少，從而判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。

 

　　實驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL。振蕩提取30 min后離心，將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發(fā)掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），渦旋1 min后調(diào)節(jié)pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經(jīng)過預(yù)處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸緩沖液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。然后用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮氣吹干，用0.025 M磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）定容殘渣至1 mL,待上機測定。

 

　　色譜條件：LabAlliance PC-2000高效液相色譜配500型紫外檢測器；

 

　　lanbo色譜柱:C18(4.6mm×150mm×5μm)；

 

　　流動相:甲醇/0.004M磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；

 

　　檢測波長:268 nm

 

　　2、直接法

 

　　方法原理：牛乳中的青霉素鉀在β-內(nèi)酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸鉀，并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質(zhì)。經(jīng)去脂肪、蛋白等前處理后，可以將青霉噻唑酸鉀提取出來，經(jīng)高效液相色譜儀檢測確認其是否存在，從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。

 

　　實驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，加入無水乙醇15 mL，振蕩提取30 min后離心，取清液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，用高效液相色譜儀檢測。

 

　　標準溶液配制：稱取0.01 g（精確至0.001 g）青霉素鉀于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解劑，室溫放置2h使青霉素鉀酶解*后用去離子水定容，得到青霉噻唑酸鉀標準溶液，濃度100μg/mL。根據(jù)實際情況稀釋后使用。